组织研磨机对提取小鼠尾巴RNA的实验步骤

组织研磨机对提取小鼠尾巴RNA的实验步骤

实验步骤

1、首先将上海净信的组织研磨机上的制冷模块预先置于-20℃，使用时取出安装好。将研磨珠去RNA酶处理。

2、随机抽取小鼠的尾巴100µg，把样本剪成尽可能小段，置于无RNA酶的2研磨单位离心管中（选择耐液氮冷冻管子），同时加入1颗5号研磨珠和2颗3号研磨珠（如果选择1.5研磨单位离心管，只需要加入4-5颗3号研磨珠）。

3、放置于液氮中一起浸泡3分钟，取出放置于预冷模块中，在全自动样品研磨仪上选择13单位频振研磨60s。（该步骤可以根据研磨的细微程度要求可以再重复一遍）

4、把研磨好的样本加入0.06ml的PBS0.14ml的RNAiso Plus（此处选择PBS，可以根据实验需要加入其他提取液，如1ml TRIzol等），继续置于研磨机上选择13单位频振研磨60s。样本将处于糊状。（其他提取试剂有可能会出现泡沫，不影响实验）

5、取出研磨管，放入冷冻离心机中，于4度，12000g离心10分钟

6、小心吸取上清液0.1ml至新的1.5研磨单位离心管中，盖上管盖，在室温上孵育15分种，使样品充分裂解至匀浆液较透明，如果仍有少量颗粒属于正常情况，不影响RNA提取质量和得率。

7、在1.5研磨单位离心管中加入0.02ml氯（空）仿，盖紧管盖，振荡混匀并将其在冰上孵育15分种，于4度，12000g离心15分钟。离心后混合物分层：上清层，中间层，下层；RNA存在于上清层中。

8、将上清层小心转移到一干净的离心管中，加入等体积冰浴的异丙醇，颠倒振荡混匀，将混合的样品在-20度条件，孵育20分种，于4度，12000g离心10分钟。RNA沉淀通常形成片状沉淀附着于管壁或管底。

小心弃去上清，用1ML的冰浴75%的乙醇洗涤RNA沉淀一次，颠倒洗涤离心管管壁，并旋涡振荡样品，尽可能让沉悬浮，于4度，12000g离心5分钟，再次去除上清，晾干沉淀。

10、操作的zui后，在阴凉处适度干燥RNA沉淀（避免过分干燥，那样会降底它的可溶性）。

11、用适量（一般可用0.01—0.02ml）的无RNA酶水或TE溶液来溶解RNA。抽提好的RNA，保存于-70度。